• ورود کاربران دانشگاهی

  • ثبت نام(مطالعه آنلاین پایان نامه ها)

  • کاربر مهمان
    پنجشنبه 30 شهریور 1396| 54.225.39.142 :Your IP

    سامانه دسترسی به پایان نامه های دانشگاه اصفهان



    عنوان :
    آپتا حسگرهای عامل دار شده با نانو ذرات: استراتژی جدیدی برای تشخیص برخی ترکیبات مهم زیستی و تشخیص زودهنگام سرطان کبد
    انتشارات : دانشگاه اصفهان
    سال :1392
    زبان : Persian
    شماره سند : 10401
    موضوع :شیمی گرایش تجزیه
    پژوهشگر : لیلا کاشفی خیرآبادی
    توصیفگر لاتین : nanoparticles ? liver cancer ? aptamer ? aptasensor ? sodium diclofenac ? adenosin triphosphate ? nanoporous ? 3,4 diaminobenzoic acid ? electrochemistry ?
    توصیفگر فارسی : نانوذره ◄ سرطان کبد ◄ آپتامر ◄ آپتاحسگر ◄ دیکلوفناک سدیم ◄ آدنوزین تری فسفات ◄ نانو متخلخل ◄ 3،4- دی آمینو-بنروئیک اسید ◄ الکتروشیمیایی
    دانشکده : دانشکده علوم، گروه شیمی
    مقطع : دکتری

    استاد راهنما : مسعود آیت اللهی مهرجردی
    استاد مشاور :
    سال دفاع : 1392
    شماره رکورد : 10401
    شماره راهنما : CHE3 108
    فهرست : فهرست مطالب
    عنوان صفحه

    فصل اول : مقدمه و تئوری
    1-1- مقدمه 1
    1-2 تئوری 3
    1-2-1-آپتامر 3
    1-2-2- آپتامر¬ها و فرآیند انتخاب از طریق SELEX 4
    1-2-3- سلکس- سلول 8
    1-2-4- کاربرد¬های زیست تجزیه¬ای آپتامرها 9
    1-2-4-1- سنجش آپتامر متصل به ردیاب 10
    1-2-4-2- خالص سازی تمایلی بر اساس آپتامر 13
    1-2-4-2-1- کروماتوگرافی 13
    1-2-4-2-2- الکتروفورز مویینه 13
    1-2-4-2-3- میکروفلوئیدیک 14
    1-2-4-3- زیست حسگرها- آپتا¬حسگرها 16
    1-2-4-3-1- آپتا¬حسگرهای شیمی نورتابی 16
    1-2-4-3-2- آپتا¬حسگرهای فلورسانس 17
    1-2-4-3-3- آپتا¬حسگرهای بر اساس نقاط کوانتومی 19
    1-2-4-3-4- آپتا¬حسگرهای رنگ سنجی 20
    1-2-5-3-5 آپتا¬حسگرهای بر اساس تشخیص جرم 21
    1-2-4-3-6- آپتا¬حسگرهای بر اساس ترانزیستور اثر میدان 25
    1-2-4-3-7- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی 27
    1-2-4-3-7-1- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی بر اساس تک لایه آپتامر فعال اکساکاهشی متصل به الکترود 27
    عنوان صفحه

    1-2-4-3-7-2- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی تقویت شده بر اساس آنزیم 32
    1-2-4-3-7-3- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی تقویت شده بر اساس نانوذرات 36
    1-2-4-3-7-4- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی بدون شناساگر بر اساس اسپکتروسکوپی مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی 37
    1-2-4-3-7-5- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی برای ملکول¬های کوچک 40
    1-2-4-3-7-5-1- آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای دیکلوفناک 42
    1-2-4-3-7-5-2- آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای آدنوزین تری فسفات (ATP) 45
    1-2-5- سرطان 50
    1-2-5-1- آپتا¬حسگرهای الکتروشیمیایی برای سلول¬های کامل 51
    1-2-5-1-1- سرطان کبد و تشخیص زود¬هنگام آن 56
    1-2-6 اهداف پروژه...................................................................................................................................58
    فصل دوم: بخش تجربی
    2-1- مواد و معرف¬های مورد¬استفاده 60
    2-2- آپتامر¬های مورد¬استفاده 62
    2-3- دستگاه¬های مورد¬استفاده 64
    2-3-1- دستگاه¬های الکتروشیمیایی 64
    2-3-2- سایر دستگاه¬های مورد¬استفاده 64
    2-3-3- دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) 64
    2-3-4- دستگاه میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) 65
    2-3-5- طیف سنجی فرابنفش- مرئی (UV-Vis.) 65
    2-4- آماده سازی محلول ها 65
    2-5- حسگر الکتروشیمیایی بر اساس آپتامر برای تشخیص دیکلوفناک 67
    عنوان صفحه

    2-5-1- ساخت حسگر 67
    2-5-2- تهیه نانوذرات نقره 68
    2-5-3- آماده¬سازی محلول نانوذره نقره /DBA برای بررسی¬های نوار پلاسمون سطحی 68
    2-5-4- اندازه¬گیری¬های الکتروشیمیایی 69
    2-5-4-1- اندازه¬گیری¬های ولتامتری چرخه¬ای 69
    2-5-4-2- اندازه¬گیری¬های مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی 69
    2-5-4-3- اندازه¬گیری¬های نوار پلاسمون سطحی 69
    2-6- آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی بر پایه نانوذرات برای تشخیص آدنوزین تری فسفات (ATP) 70
    2-6-1- ساخت حسگر ATP 70
    2-6-2- اندازه¬گیری¬های الکتروشیمیایی 71
    2-6-2-1- اندازه¬گیری¬های ولتامتری پالس تفاضلی 71
    2-6-2-2- اندازه¬گیری¬های مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی 71
    2-7- توسعه آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص آدنوزین تری فسفات (ATP) با استفاده از یک بستر نانومتخلخل 72
    2-7-1- آماده سازی الکترود طلای نانومتخلخل (NPGE) 72
    2-7-2- سل الکتروشیمیایی 73
    2-7-3- اصلاح سطح الکترود طلای نانومتخلخل 74
    2-7-4- اندازه¬گیری¬های الکتروشیمیایی 74
    2-8- توسعه آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص زود¬هنگام سلول¬های کامل (کبد) 75
    2-8-1- تثبیت آپتامر روی سطح الکترود طلا 75
    2-8-2- اصلاح کریستال QCM 75
    2-8-3- کشت و تثبیت سلولی 75
    2-8-4- آزمایش MTT 76
    عنوان صفحه

    2-8-5- اندازه¬گیری¬های الکتروشیمیایی 76
    2-8-6- اندازه¬گیری¬های کوارتز کریستال میکروبالانس 77
    فصل سوم :نتایج و بحث78
    3-1- طراحی و ساخت یک آپتا¬حسگر بدون شناساگر برای تشخیص الکتروشیمیایی سدیم دیکلوفناک 79
    3-1-1- اکسیداسیون سطح الکترود کربن شیشه¬ای، انتخاب پتانسیل و زمان بهینه اکسایش الکتروشیمیایی 79
    3-1-2- بهینه¬سازی زمان فعال¬سازی گروه¬های اسیدی سطح الکترود کربن شیشه¬ای 80
    3-1-3- بهینه¬سازی زمان تثبیت 6- آمینوهگزانوییک اسید (AHA) روی سطح الکترود کربن شیشه¬ای حاوی گروه¬های اسیدی فعال¬سازی شده 81
    3-1-4- بهینه¬سازی غلظت آپتامر تثبیت شونده روی سطح الکترود 82
    3-1-5- بهینه¬سازی زمان تثبیت آپتامر ویژه دیکلوفناک (DBA) 83
    3-2-5- بهینه¬سازی زمان برهمکنش آپتامر DBA و دیکلوفناک 84
    3-1-6- سنتز وبررسی نانوذرات نقره برای مطالعات پلاسمونیک 85
    3-1-7- بررسی ابعاد نانوذرات نقره با روش میکروسکوپ الکترون عبوری TEM 85
    3-1-8- توصیف خصوصیات الکتروشیمیایی حسگر اصلاح شده 87
    3-1-9- تعیین میزان پوشش سطحی آپتامر DBA 89
    3-1-10- تعیین خصوصیات تجزیه¬ای حسگر (GCE/AHA/DBA) برای تعیین مقدار کمی دیکلوفناک 90
    3-1-11- تکرارپذیری، انتخاب پذیری، و پایداری آپتا¬حسگر 95
    3-1-12- مطالعات پلاسمون سطحی 96
    3-2- نانوذرات نقره جفت شده با آپتامر برای تشخیص الکتروشیمیایی آدنوزین تری فسفات 100
    3-2-1- سنتز و شناسایی نانوذرات نقره 100
    3-2-2- بررسی رفتار الکتروشیمیایی نانوذرات نقره بر روی سطح الکترود طلا در pHهای مختلف 100
    3-2-2-تعیین سطح الکترود طلا 101
    3-2-3- ساخت آپتا¬حسگر اصلاح شده با نانوذرات نقره 102
    عنوان صفحه

    3-2-4- تعیین صفات اختصاصی الکتروشیمیایی سطح حسگر 103
    3-2-5- بهینه سازی مراحل ساخت زیست حسگر 104
    3-2-6- رفتار الکتروشیمیایی آپتا¬حسگر ATP در حضور و غیاب ملکول هدف. 106
    3-2-7- تعیین میزان پوشش سطحی آپتامر 107
    3-2-8- بررسی¬های ولتامتری 108
    3-2-9- گزینش پذیری، پایداری و تکرار پذیری آپتا¬حسگر ATP 108
    3-3- توسعه یک زیست حسگر الکتروشیمیایی بر اساس آپتامر تقویت شده برای تشخیص آدنوزین تری فسفات با استفاده از یک بستر طلای نانومتخلخل 112
    3-3-1- رفتار الکتروشیمیایی DABA در سطح الکترود طلا برهنه 112
    3-3-2- آماده¬سازی الکترود طلای نانومتخلخل 113
    3-3-3- اصلاح سطح حسگر و تعیین صفات اختصاصی آن 115
    3-3-4- بهینه¬سازی مراحل ساخت زیست¬حسگر 118
    3-3-5- بررسی رفتار الکتروشیمیایی آپتا¬حسگرATP بر پایه الکترود نانومتخلخل در حضور گزارش¬گر ملکولی DABA. 120
    3-3-6- تعیین میزان پوشش سطحی آپتامر 121
    3-3-7- کارایی تجزیه¬ای آپتا¬حسگر 122
    3-3-8- گزینش پذیری، پایداری و تکرارپذیری آپتا¬حسگر 122
    3-4- تشخیص بر اساس آپتامر بدون شناساگر سلول¬های سرطان کبد 126
    3-4-1- آپتا¬سنسینگ سلول کامل 127
    3-4-2- تعیین مقدار چگالی سطحی آپتامر 133
    3-4-3- کارایی تجزیه¬ای آپتا¬حسگر 133
    3-4-4- زیست¬سازش¬پذیری سلول 139
    نتیجه¬گیری و دورنمای آینده 140



    چکیده :
    چکیده: آپتامر¬ها ملکول¬های DNAیا RNA تک رشته¬ای هستند که از طریق یک فرآیند انتخاب و تقویت درون آزمایشگاهی جداسازی می-شوند. آپتامر¬ها با تمایل و ویژگی بالا با ثابت تفکیک قابل مقایسه با پادتن¬ها به گستره وسیعی از ملکول¬های هدف متصل می-شوند. در این کار پژوهشی آپتامر¬ها به¬عنوان یک نوع جدید از لایه¬های زیست¬تشخیص در زیست¬حسگر¬ها برای تشخیص ملکول¬های کوچک و سلول کامل به¬کار گرفته شدند. این تحقیق بر روی تشخیص الکتروشیمیایی سدیم دیکلوفناک و آدنوزین تری¬فسفات (ملکول-های کوچک) و سلول سرطان کبد (سلول کامل) به¬عنوان دو نمونه از هدف¬های آپتامر متمرکز گردید. تلاش به سمت استفاده از این آپتا¬حسگر¬ها در بافت¬های پچیده، و سرم¬خون انسان، به منظور نشان دادن کاربرد گسترده¬ی آپتامرها، به عنوان یک جایگزین برای پادتن نیزانجام شد. در بخش نخستین، یک آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی بدون شناساگر برای تشخیص سدیم¬دیکلوفناک ارائه گردید. برای ساخت این آپتا-حسگر، آپتامر دیکلوفناک عامل¬دار شده با آمین، روی سطح یک الکترود کربن شیشه¬ای به¬طور کووالانسی متصل شد. هنگامی¬که الکترود اصلاح¬شده با آپتامر در معرض غلظت¬های مختلف دیکلوفناک قرارمی¬ گیرد ساختار آپتامر روی سطح الکترود تغییر می¬کند. حضور دیکلوفناک یک تغییر در ساختار آپتامر تثبیت شده بر روی سطح القاء می¬کند و سبب کاهش مقاومت بار آپتا¬حسگر می¬شود. به¬هر حال مقاومت انتقال بار با خواباندن الکترود/آپتامر/دیکلوفناک با آپتامر ثانویه افزایش می¬یابد. تغییرات در مقاومت انتقال بار با استفاده از تکنیک¬های ولتامتری و اسپکتروسکوپی مقاومت ظاهری الکتروشیمیایی دنبال شد. آپتا¬حسگر دو گستره دینامیک خطی مختلف بینmM 5-0 و mM 1- mM 10 نشان داد و حساسیت 7/15 کیلو¬اهم بر میکرو¬مولار و حد¬تشخیص 7-10 × 7/2 مولار برای آن به¬دست آمد. در بخش بعدی توانایی نانو¬ذرات نقره به¬عنوان برچسب اکسا-کاهشی در ساخت یک آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص آدنوزین تری فسفات مورد¬بررسی قرار گرفت. برای ساخت آپتا-حسگر، یک آپتامر شناخته شده برایATP به دو قسمت تقسیم شد. قسمت آمین¬دار شده اول آپتامر به¬طور کووالانسی روی سطح الکترود طلای اصلاح شده با 3- مرکاپتوپروپیونیک اسید از طریق تشکیل پیوند کربودی¬ایمید تثبیت شد. قسمت دوم آپتامر با نانوذرات نقره اصلاح شد و در حضور ATP با قسمت اول تجمع یافت. سیگنال اکسایش مستقیم نانو¬ذرات نقره به¬عنوان سیگنال تجزیه¬ای برای تشخیص ATP دنبال شد. سنجش ساندویچی به¬کار برده¬شده بازده سیگنال مناسب و مهم¬تر از آن زمان پاسخ خوبی نشان داد. با این حسگر می¬توان غلظت ATP را در مقیاس میکرو-مولار با پایداری بسیار مطلوب تحت شرایط بهینه اندازه¬گیری نمود. گذشته از آن نوکلوتید¬های مشابه شامل GTP، CTP، و UTP مزاحمت جدی نشان نداد و این حسگر هدفش را در محیط¬های پیچیده مانند پلاسمای خون انسان به¬راحتی تشخیص داد. با وجود کاربرد¬های نوید¬بخش آپتامر¬ها در آزمایشات زیستی، توسعه زیست¬حسگر¬های الکتروشیمیایی بر اساس آپتامر با حد-تشخیص بهبود¬یافته هنوز به¬عنوان یک چالش اساسی مطرح است. در این راستا، یک راه¬برد برای تقویت سیگنال بر اساس کاربرد نانو¬ساختار¬ها به¬عنوان بستر¬هایی برای ساخت یک آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای ATP در بخش دیگر این پایان¬نامه معرفی شده¬است. یک آزمایش ساندویچی از طریق تثبیت یک قطعه از آپتامر ویژه ATP بر روی سطح الکترود طلای نانو¬متخلخل (NPGE) و تجمع آن با قطعه دوم آپتامر در حضور ملکول ATP طراحی شد. به دنبال آن ترکیب 3،4- دی¬آمینو¬بنزوییک اسید (DABA) به-عنوان یک گزارشکر ملکولی به عامل آمین قطعه دوم آپتامر متصل شد و سیگنال اکسایش مستقیم آن به¬عنوان سیگنال تجزیه¬ای دنبال گردید. نتایج نشان داد که حد تشخیص آپتا¬حسگر برای اندازه¬گیری ATP ده برابر بهبود یافته¬است و. با این آپتا-حسگر می¬توان غلظت¬های ATP را در مقیاس¬های کمتر از میکرو¬مولار تشخیص داد. بخش نهایی رساله حاضر به توسعه یک آپتا¬حسگر الکتروشیمیایی برای تشخیص سلول¬های سرطانی اختصاص داده شده است. تشخیص زود¬هنگام سرطان¬ها چالشی برای امکان درمان مؤثر است و آپتامر¬ها ردیاب¬های ملکولی بسیار نوید¬بخشی در این زمینه هستند. طی دو دهه اخیر آن¬ها به¬عنوان یک گروه جدید از ملکول¬های تشخیص برای تشخیص سلول¬های کامل از طریق فرآیند سل- سلکس انتخاب شده¬اند. با بهره¬گیری از آپتامر TLS11a که به¬طور ویژه به سطح غشاء سلول¬های سرطان کبد متصل می¬شود یک راهبرد سر¬راست برای تشخیص سرطان کبد در مراحل اولیه معرفی-شده¬است. جهت ساخت زیست¬حسگر، شرایط مختلف تثبیت آپتامر TLS11a آمین¬دار¬شده بر روی الکترود طلای اصلاح شده با MPA از طریق شیمیEDC/NHS و استفاده از آن در یک قالب ساندویچی، بهینه شد. استفاده از آپتامر TLS11a به¬عنوان لایه تشخیص، حسگری با تمایل بالا برای سلول¬های سرطانیHepG2 در مقایسه با سلول¬های سرطانی کنترل پروستات، سینه و روده انسان ارائه می¬کند. آپتاحسگر یک گستره دینامیک خطی وسیع از 102 × 1 تا 106 × 1 سلول بر میلی¬لیتر با حد¬تشخیص 2 سلول بر میلی¬لیترارائه داد. این پروتکل یک ابزار دقیق برای تشخیص حساس سرطان کبد با مزایای مهمی مانند سادگی، قیمت پایین و پایداری ارائه می¬دهد. کلید¬واژه¬ها: آپتامر، آپتا¬حسگر، سدیم دیکلوفناک، آدنوزین-تری¬فسفات، نانو¬ذره نقره، نانو¬متخلخل، 3،4- دی¬آمینو¬بنزوئیک اسید، سرطان، سلول HepG2.

    چکیده انگلیسی :
    Abstract: Aptamers are single-stranded DNA or RNA molecules isolated in vitro by a selection and amplification method. Aptamers bind with high specificity and affinity to a wide range of target molecules, with dissociation constant comparable to antibodies. In this work aptamers were employed as a new kind of bio-recognition layers in affinity biosensors for detection of small molecules and whole cells. This research was focused on electrochemical detection of Sodium Diclofenac and adenosine tri phosphate (small molecules) and Liver cancer cell (whole cell) as two paradigms of aptamer targets. Efforts towards the application of these aptasensors in complex matrices, such as human plasma and serum, were also undertaken, in order to demonstrate the wide applicability of aptamers, as an alternative to antibodies. A label free electrochemical aptasensor for the detection of Sodium Diclofenac was presented in the first section of the thesis. In order to construct the biosensor; the amino-functionalized Diclofenac binding aptamer (DBA) was covalently immobilized on the surface of the glassy carbon electrode (GCE). The conformation of the DBAs on the surface of the electrode is changed when this is exposed to different concentrations of DCF. The introduction of DCF induces an alteration in the conformation of the surface immobilized DBA and causes a decrease in the charge transfer resistance of the aptasensor. However, the charge transfer resistance is increased by incubation of GCE/DBA/DCF in the secondary DBA. The changes in the charge transfer resistance were monitored using the voltammetric and electrochemical impedance spectroscopic (EIS) techniques. The aptasensor shows two different linear dynamic ranges over 0–5.0 µM and 10 µM to 1 mM, and the sensitivity of 15.7 kΩ. µM−1 and detection limit of 2.7×10−7 M were obtained. In the next section of this research the capability of silver nanoparticles (SNP) as redox tag in the construction of an electrochemical aptasensor for the detection of adenosine triphosphate (ATP) was investigated. To construct the aptasensor, a well-known ATP binding aptamer (ABA) was split into two segments. The first amino-labeled segment of the aptamer was covalently immobilized on 3-mercaptopropionic acid modified gold electrode surface by the formation of carbodiimide bond. The second segment was modified by SNPs and associated with the first segment in the presence of ATP. The direct oxidation signal of SNPs is followed as the analytical signal to detect ATP. The sandwich assay shows a suitable signal gain and importantly, a good response time. The sensor can detect the concentrations of ATP as low as micromolar scales with a desirable stability under optimum conditions. Furthermore, analog nucleotides including GTP, UTP and CTP, do not show serious interferences and this sensor readily detected its target in a complex media such as human blood plasma. In spite of the promising applications of aptamers in the bioassays, the development of aptamer-based electrochemical biosensors with the improved limit of detection has remained a great challenge. In this regard, a strategy for the amplification of signal, based on application of nanostructures as platforms for the construction of an electrochemical adenosine triphosphate (ATP) aptasensor, was introduced in the another section of this thesis. A sandwich assay was designed by immobilizing a fragment of ATP binding aptamer on a nanoporous gold electrode (NPGE) and its association to second fragment in the presence of ATP. Consequently, 3, 4-diaminobenzoic acid (DABA), as a molecular reporter, was covalently attached to the amine-label of the second fragment, and the direct oxidation signal of DABA was followed as the analytical signal. Results demonstrated limit of detection of the aptasensor for measuring of ATPhas been enhanced as much as 10 times and the sensor can detect the concentrations of ATP as low as submicromolar scales. The last part of the present thesis has been devoted to develop of an electrochemical aptasensor for detection of cancer cells. Early diagnosis of cancers remains a challenge for their effective treatment and aptamers are highly promising molecular probes in this field. During the last two decades, they have been selected through a process named cell-SELEX as a new class of recognition molecules for whole-cells recognition. Taking advantage of the TLS11a aptamer, which specifically binds to the membrane surface of hepatocellular carcinoma cells, a straightforward strategy for early diagnosis of liver cancer was introduced. In the fabrication of the biosensor, various conditions for immobilisation of amino-labeled TLS11a onto the MPA-modified gold electrode via EDC/NHS coupling chemistry, and its application in a sandwich-assay format, were optimised. The application of TLS11a aptamer as a recognition layer resulted in a sensor with high affinity for HepG2 cancer cells in comparison with control cancer cells of human prostate, breast and colon tumours. The aptasensor delivered a wide linear dynamic range over 1 × 102 – 1 × 106 cell/mL, with a detection limit of 2 cell/mL. This protocol provides a precise tool for sensitive diagnosis of liver cancer with significant advantages in terms of simplicity, low cost, and stability. Keywords: Aptamer, Aptasensor, Sodium Diclofenac, Adenosine triphosphate, Silver nanoparticle, Nonporous, 3,4-diaminobenzoic acid, Cancer, HepG2 cell.


    کلید واژه ها :
    نانوذره ◄ سرطان کبد ◄ آپتامر ◄ آپتاحسگر ◄ دیکلوفناک سدیم ◄ آدنوزین تری فسفات ◄ نانو متخلخل ◄ 3،4- دی آمینو-بنروئیک اسید ◄ الکتروشیمیایی,nanoparticles ◄ liver cancer ◄ aptamer ◄ aptasensor ◄ sodium diclofenac ◄ adenosin triphosphate ◄ nanoporous ◄ 3,4 diam

    1392
    0

    صفحه اول : University of Isfahan Faculty of Chemistry Ph.D Thesis Nanoparticles functionalized Aptasensors: “A New Strategy for Detection of Some Biologically Important Compounds” & Early Diagnosis of Liver Cancer Supervisor: Dr. Masoud Ayatollahi Mehrgardi By: Leila Kashefi Kheyrabadi July 2013
    فصل اول : 1-59
    فصل دوم : 60-77
    فصل سوم : 78-156
    فصل چهارم :
    فصل پنجم :
    فصل ششم :