• ورود کاربران دانشگاهی

  • ثبت نام(مطالعه آنلاین پایان نامه ها)

  • سپندا

    کاربر مهمان
    پنجشنبه 2 آذر 1396| 54.146.50.80 :Your IP
    سامانه پایان نامه های دانشگاه اصفهان (سپندا)



    عنوان :
    اتصال آنتیبادی آنتی هپاتیت B به نانوذرات مغناطیسی برای تشخیص آنتیژن سطحی ویروس هپاتیت B
    انتشارات : دانشگاه اصفهان
    سال :1394
    زبان : Persian
    شماره سند : 13534
    موضوع :زیست فناوری گرایش میکروبی
    پژوهشگر : سعید تایبی
    توصیفگر لاتین : Magnetic nanoparticles ? Hepatitis B surface antigen ? Anti hepatitis B antibody ? Sandwich Elisa ? Glucoamylase ? Glucometer
    توصیفگر فارسی : نانوذرات مغناطیسی ◄ آنتیژن سطحی هپاتیت B ◄ آنتیبادی آنتیهپاتیت B ◄ الایزا ساندویچی ◄ گلوکوآمیلاز ◄ گلوکومتر
    دانشکده : دانشکده علوم و فناوری نوین، گروه زیست فناوری
    مقطع : کارشناسی ارشد

    استاد راهنما : مهرناز کیهانفر
    استاد مشاور : سید عبدالله نوربخش رضایی
    سال دفاع : 1394
    شماره رکورد : 13534
    شماره راهنما : BIOTECH2 112
    فهرست : فهرست مطالب
    عنوان صفحه
    فصل اول: مقدمه
    1-1- هپاتیت‌های ویروسی 1
    1-2- معرفی ویروس هپاتیت B 3
    1-2-1- ساختار ویروس 4
    1-2-2- بیماری‌زایی ویروس 4
    1-2-3- هپاتیت حاد .4
    1-2-4- هپاتیت مزمن 5
    1-2-5-کارسینومای کبد .5
    1-3- آنتی‌بادی 5
    1-3-1-ساختار مولکولی آنتی‌بادی .6
    1-3-2-ویژگی عمومی ساختمان آنتی‌بادی 7
    1-3-3- آنتی‌بادی مونوکلونال. .9
    1-3-4- کاربرد آنتی‌بادی مونوکلونال ...11
    1-3-5-آنتی‌بادی‌های نوترکیب 12
    1-3-6- واکنش های آنتی ژن- آنتی بادی 12
    1-3-7- روش های تثبیت آنتی بادی .13
    1-3-7-1-اتصال کووالان 13
    1-3-7-2- جذب فیزیکی 14
    1-3-7-3- تثبیت به کمک بیوتین- استرپتوآویدین 14
    1-3-8-آویدین/استرپتوآویدین-بیوتین 16
    1-3-8-1-آویدین و استرپتوآویدین 16

    عنوان صفحه
    1-3-8-2-بیوتین 16
    1-3-8-3- برهم کنش بیوتین- آویدین به عنوان سیستم شناسایی .16
    1-4- روش‌های ایمنی‌سنجی 19
    1-4-1-ایمنوبلات و رسوب دهی ایمنی 20
    1-4-2- آزمون جذب ایمنی متصل به آنزیم 21
    1-5- مواد نشاندار 22
    1-5-1- نشاندار کردن آنتی‌بادی با مواد رادیواکتیو .22
    1-5-2- نشاندار کردن آنتی‌بادی با مواد فلوروکروم .23
    1-5-3- نشاندار کردن آنتی‌بادی‌ها با کوانتوم دات ها ..24
    1-5-4- نشاندار کردن آنتی‌بادی‌ها با آنزیم‌ها .24
    1-5-4-1- آنزیم پراکسیداز ترب کوهی 25
    1-5-4-2- آنزیم آلکالین فسفاتاز 25
    1-5-4-3- آنزیم بتا- گالکتوزیداز 26
    1-5-4-4- آنزیم گلوکوآمیلاز 26
    1-6- روش های اتصال .26
    1-6-1- پروتئین‌های ترکیبی ..27
    1-6-2- برهمکنش بیوتین- استرپتوآویدین (آویدین) .27
    1-6-3- استفاده از پروتئین‌های حد واسط 28
    1-6-4- استفاده از نانوذرات .28
    1-7- آنزیم گلوکوآمیلاز 28
    1-8- نشاسته 30
    1-8-1- آمیلوز 31
    عنوان صفحه
    1-8-2- آمیلوپکتین 31
    1-9- مقدمه‌ای بر نانوفناوری 33
    1-9-1-تاریخچه نانوفناوری 33
    1-9-2- نانوذرات و زیست‌فناوری 34
    1-9-2-1- انواع نانوذراتی که در زیست پزشکی کاربرد دارند 34
    1-9-2-2- کاربرد و اهمیت استفاده از نانوذرات مغناطیسی 34
    1-9-2-3- آلومینا 35
    1-9-3- انواع موتیف‌هایی که می‌توانند به نانوذرات وصل شوند. 36
    1-9-3-1- اتصال آنتی‌بادی به نانوذرات 36
    1-9-3-2- ویژگی‌های نانوذرات در کنار ویژگی‌های آنتی‌بادی 38
    1-9-4- روش‌های اتصال نانوذرات به آنتی‌بادی 38
    1-9-4-1- پیوند کوالانسی 39
    1-9-4-2-امتیازات استفاده از پیوند کووالانسی. 39
    1-10- زیست حسگرها 39
    1-10-1- ایمونوحسگرها 40
    1-10-2- گلوکومتر 40
    1-11- اهداف 41
    فصل دوم: مواد و روش‌ها
    2-1- مواد وکیت‌های تشخیصی استفاده شده 42
    2-2- دستگاه‌های مورد استفاده 44
    2-3- تهیه بافرها 45
    2-3-1- روش تهیه بافر فسفات نمکی 45

    عنوان صفحه
    2-3-2- روش تهیه بافر سیترات 46
    2-3-3- روش تهیه بافر شستشو 46
    2-3-4- روش تهیه محلول بلاکینگ 46
    2-4- تعیین غلظت آنزیم و آنتی‌بادی بیوتینیله 47
    2-4-1- تهیه معرف بردفورد 48
    2-4-2- رسم منحنی استاندارد 48
    2-4-3- تعیین غلظت آنزیم و آنتی‌بادی. .49
    2-5- مقایسه دقت سنجش گلوکز میان کیت گلوکز و گلوکومتر 49
    2-6- اتصال آنتی‌بادی بیوتینیله به نانوذرات مغناطیسی استرپتوآویدین‌دار 49
    2-6-1- آزمایش آنتی‌بادی اتصال یافته به کمک آنتی‌ژن کونژوگه شده به آنزیم پراکسیداز 50
    2-6-2- انتخاب بهترین مقداراولیه آنتی‌بادی بیوتینیله برای اتصال به نانوذرات استرپتوآویدین‌دار 50
    2-6-3- آزمایش آنتی‌بادی اتصال یافته به کمک آنتی‌ژن کونژوگه 51
    2-7- اتصال آنتی‌بادی ثانویه و آنزیم گلوکوامیلاز به نانوذرات Al2O3 51
    2-7-1- آزمایش‌های اولیه 51
    2-7-2- اصلاح سطح نانوذرات Al2O3 52
    2-7-3- تثبیت آنزیم گلوکوآمیلاز در سطح نانوذرات اصلاح شده 52
    2-7-4- انتخاب بهترین مقدار اولیه آنزیم افزوده شده 53
    2-7-5- بهترین شرایط برای فعالیت آنزیم 53
    2-7-6- تثبیت آنتی‌بادی آنتی‌هپاتیت B (آنتی‌بادی ثانویه) 53
    2-7-7- انتخاب بهترین مقدار اولیه آنتی‌بادی آنتی‌هپاتیتB افزوده شده 54
    2-7-7-1- به دام افتادن آنتی‌ژن توسط آنتی‌بادی اولیه - نانوذره مغناطیسی 54

    عنوان صفحه
    2-7-7-2- تشکیل ساندویچ ایمنی 54
    2-8- آزمایش آنتی‌بادی اتصال یافته به کمک استرپتوآویدین- پراکسیداز 55
    2-9- تشخیص زمان لازم برای تشکیل ساندویچ ایمنی 55
    2-10- بررسی گزینش‌پذیری روش بررسی شده 56
    2-11- مراحل آزمایش جهت ترسیم منحنی کالیبراسیون 56
    2-12- مقایسه روش بررسی شده با کیت تجاری مشابه 57
    2-13-آنالیز داده‌ها 59
    2-14-طرح کلی پژوهش 59
    فصل سوم : نتایج
    3-1- مقدمه………..……………………………………………………………………………………………………..… 61
    3-2- تعیین غلظت آنزیم و آنتی‌بادی بیوتینیله 61
    3-3- مقایسه دقت سنجش گلوکز میان کیت گلوکز و گلوکومتر 62
    3-4- اتصال آنتی‌بادی بیوتینیله به نانوذرات مغناطیسی استرپتوآویدین‌دار 63
    3-5- انتخاب بهترین مقدار اولیه آنتی‌بادی بیوتینیله برای اتصال به نانوذرات مغناطیسی استرپتوآویدین‌دار. 64
    3-6- اتصال آنتی‌بادی ثانویه و آنزیم گلوکوآمیلاز به نانوذرات Al2O3 66
    3-6-1- نانوذرات Al2O3. 66
    3-6-2- اصلاح سطح نانوذرات Al2O3 67
    3-6-2-1- مرحله اول: آمین ‌دار کردن سطح نانوذرات آلومینا 67
    3-6-2-2- مرحله دوم: اصلاح سطح نانوذرات آلومینای آمین‌دار شده 67
    3-6-3- طیف FTIR 68

    عنوان صفحه
    3-6-4- تثبیت آنتی‌بادی ثانویه و آنزیم گلوکوآمیلاز به نانوذرات آلومینا 69
    3-6-4-1- طیف FTIR 70
    3-6-5- انتخاب بهترین زمان تثبیت آنزیم 71
    3-6-6- انتخاب بهترین مقدار اولیه گلوکوآمیلاز افزوده شده 72
    3-6-7- بهترین شرایط فعالیت آنزیم 74
    3-6-8- تثبیت آنتی بادی آنتی‌ هپاتیت B 76
    3-6-9- انتخاب بهترین مقدار اولیه آنتی‌بادی ثانویه افزوده شده 77
    3-7- آزمایش اتصال آنتی‌بادی ثانویه روی نانوذرات آلومینا از طریق تشکیل ساندویچ ایمنی بدون تثبیت آنتی‌بادی بیوتینیله روی نانوذرات مغناطیسی 79
    3-8- انتخاب بهترین زمان لازم برای تشکیل ساندویچ ایمنی 80
    3-9- بررسی گزینش‌پذیری روش بررسی شده 81
    3-10: ترسیم منحنی کالیبراسیون و مقایسه با کیت تجاری 82
    3-11- آنالیز داده‌ها 87
    3-11-1- بررسی رابطه خطی داده ها 87
    3-11-2- محاسبه حد تشخیصی روش بررسی شده در این پژوهش 88
    فصل چهارم: نتایج
    4-1- بحث 91
    4-2-پیشنهاداتی برای ادامه‌ی پژوهش حاضر 97


    چکیده :
    چکیده: ویروس هپاتیت B دهمین عامل عفونی منجر به مرگ‌ و میر در سراسر جهان ‌است. ژنوتیپ D شایعترین ژنوتیپ در ایران است (زیر نوع‌ها (ayw-ayw2-ayw. مهم‌ترین عامل تشخیص و غربالگری برای عفونت هپاتیت B آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B است. بررسی آنتی‌ژن سطحی این ویروس از سال 1967 به عنوان شاخص قابل قبولی در این زمینه از سوی سازمان‌های انتقال خون سراسر دنیا پذیرفته شده است. برای تشخیص آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B به طور گسترده از روش الایزا استفاده می‌گردد. در این روش تمایل خاص بین آنتی‌بادی و آنتی‌ژن مربوط به آن، به اصطلاح روش سنجش ایمنی نامیده می‌شود که روش تحلیلی امیدوار کنندهای را برای استفاده در روش تشخیص کلینیکی و تحلیل بیوشیمایی فراهم می‌آورد. هدف از این مطالعه بهبود تشخیص آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B به روش الایزا با بهره‌گیری از نانوذرات مغناطیسی و گلوکومتر است. نانوذرات مغناطیسی به طور گسترده‌ای به عنوان یک حامل آنتی‌بادی در آزمایشگاه‌های بالینی استفاده می‌شود و تبدیل به یک فرمت استاندارد برای روشی با توان بالا شده است. حسگرهای زیستی قند یکی از محبوب‌ترین و گسترده‌ترین دستگاه‌های آزمایش مراقبتی است. در این مطالعه یک روش الایزای جدید برای نشانگرهای زیستی پروتئین بر اساس یک استراتژی تشخیص قند به کمک گلوکومتر طراحی شده است. آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B به عنوان مولکول هدف برای اندازه‌گیری انتخاب گردید. سیستم الکتروشیمیایی الایزا با استفاده از آنتی‌بادی آنتی هپاتیت B تثبیت شده روی نانوذرات مغناطیسی، به عنوان آنتی‌بادی جذب کننده (آنتی‌بادی اولیه) و همچنین اتصال آنزیم گلوکوآمیلاز و آنتی‌بادی ‌آنتی هپاتیت B ثانویه ) آنتی بادی ثانویه( روی نانوذرات Al2O3 صورت گرفته است. پس از تشکیل کمپلکس ساندویچ آنتی‌بادی اولیه تثبیت شده روی نانوذرات مغناطیسی و آنتی‌بادی ثانویه تثبیت شده روی نانوذرات Al2O3، در حضور آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B، نشاسته توسط گلوکوآمیلاز به گلوکز تبدیل می‌شود. غلظت آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B بر اساس رابطه خطی بین آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B و قند تولید شده محاسبه می‌شود‌. غلظت می‌تواند توسط بیوسنسور گلوکز اندازه‌گیری شود. در مجموع نتایج بدست آمده و مقایسه روش بررسی شده با کیت تجاری نشان ‌می‌دهد روش طراحی شده از نظر حساسیت، ویژگی تشخیصی و تکرار پذیری می‌تواند برای تشخیص عفونت هپاتیت B در نمونه‌ها به کار رود. این روش حد تشخیصی 3/0 و 4/0 نانوگرم بر میلی‌لیتر را به ترتیب برای آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B زیر نوع ay و ad را در شرایط بهینه نشان داد. کلمات کلیدی: نانوذرات مغناطیسی، آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B، آنتی‌بادی آنتی‌هپاتیت B، الایزا ساندویچی، گلوکوآمیلاز، گلوکومتر.

    چکیده انگلیسی :
    Abstract: Hepatitis B virus (HBV) infection is the 10th leading cause of death worldwide. Genotype D is most prevalent genotype in Iran (ayw-ayw2-ayw3 subtypes).The most important diagnostic and screening marker for HBV infection is Hepatitis B surface antigen (HbsAg). Studies of the surface antigen of this virus in 1967 as an acceptable indicator in the field of blood transfusion organizations around the world have been accepted. For the detection of hepatitis B surface antigen widely used ELISA. The most widely used HbsAg screening test is Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). In this way, Specific affinity between antibody and corresponding antigen,so-called immunoassay, provides a promising analytical method for clinical assay and biochemical analysis. The purpose of this study an ELISA assay has been developed for detection of HBsAg using Magnetic nanoparticles (MNPs) and glucometer. Magnetic nanoparticles widely used as a carrier of antibody in clinical laboratories and have become one of standard formats in high-throughput assay. Glucose biosensors are one of the most popular and widely used point-of-care testing devices.In this study a novel electrochemical enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for protein biomarkers has been developed based on a glucose detection strategy. Hepatitis B surface antigen was considered as the target protein. An electrochemical ELISA. System was constructed using anti hepatitis B antibody immobilized on MNPs as the capture antibody (primary antibody) and anti Hepatitis B antibody(secondary antibody( with glucoamylase binding on Al2O3. After formation of the sandwich complex, the antibody immobilized on magnetic nanoparticles and secondary antibody immobilized on Al2O3NPs converted starch into glucose by glucoamylase in the presence of hepatitis B surface antigen .The concentration of Hepatitis B surface antigen can be calculated based on the linear relation between hepatitis B surface antigen and glucose, the concentration of which can be detected by the glucose biosensor. In conclusion, the results indicate that the designed assay is comparable to the commercial kit in terms of sensitivity, specificity and reproducibility could be employed for diagnosis of HBV infection in samples.This assay showed detection limit values of 0.3 to 0.4 ng/ml for “ad” and “ay” subtypes of HbsAg was obtained under optimal conditions. Keywords: Magnetic nanoparticles, Hepatitis B surface antigen, Anti hepatitis B antibody, Sandwich Elisa, Glucoamylase, Glucometer.


    کلید واژه ها :
    نانوذرات مغناطیسی ◄ آنتیژن سطحی هپاتیت B ◄ آنتیبادی آنتیهپاتیت B ◄ الایزا ساندویچی ◄ گلوکوآمیلاز ◄ گلوکومتر,Magnetic nanoparticles ◄ Hepatitis B surface antigen ◄ Anti hepatitis B antibody ◄ Sandwich Elisa ◄ Glucoamylase ◄ Glucometer

    مهر ماه 1394
    0

    صفحه اول : University of Isfahan Faculty of Advanced Sciences and Technologies Department of Biotechnology M.Sc Thesis Conjugation of anti hepatitis B antibody to magnetic nanoparticles for Improving the detection of hepatitis B virus surface antigen Supervisor: Dr. Mehrnaz Keyhanfar Advisor: Dr. Seyed Abdollah Noorbakhshrezaei By: Saeed Taebi October 2015
    فصل اول : 1-41
    فصل دوم : 42-60
    فصل سوم : 61-90
    فصل چهارم : 91-110
    فصل پنجم :
    فصل ششم :