• ورود کاربران دانشگاهی

  • ثبت نام(مطالعه آنلاین پایان نامه ها)

  • سپندا

    کاربر مهمان
    پنجشنبه 2 آذر 1396| 54.146.50.80 :Your IP
    سامانه پایان نامه های دانشگاه اصفهان (سپندا)



    عنوان :
    استخراج آنزیم همولیزین از باسیلوس ها و بررسی خواص آن از طریق بیوانفورماتیک
    انتشارات : دانشگاه اصفهان
    سال :1392
    زبان : Persian
    شماره سند : 11112
    موضوع :زیست فناوری گرایش میکروبی
    پژوهشگر : نیلوفر ساسانی
    توصیفگر لاتین : Hemolysin , M3 strain , Zymography , Bacillus pumilus SAFR032 , Autodock , Gromax
    توصیفگر فارسی : همولیزین ? باسیلوس M3 ? باسیلوس پامیلوسSAFR032 ? اتوداک ? گرومکس
    دانشکده : دانشکده علوم و فناوری های نوین، گروه زیست فناوری
    مقطع : کارشناسی ارشد

    استاد راهنما : حسن محبت کار، گیتی امتیازی
    استاد مشاور :
    سال دفاع : 1392
    شماره رکورد : 11112
    شماره راهنما : BIOTECH2 65
    فهرست :
    فهرست مطالب

    عنوان صفحه
    فصل اول: مقدمه 1
    1-1- باسیلوس‌ها 1
    1-2- آنزیم¬ها و توکسوآنزیم¬های تولیدی توسط باسیلوس¬ها 3
    1-2-1- سموم باکتریایی 4
    1-2-1-1- سموم اثر کننده بر روی غشاء 6
    1-2-1-1-1- سموم ایجاد کننده¬ی حفره 7
    1-2-1-1-1-1- سموم ایجاد کننده¬ی حفره در باکتری¬های گرم منفی 7
    1-2-1-1-1-2- سموم باکتری¬های گرم مثبت 7
    1-3- سموم وابسته به کلسترول 9
    1-3-1- وجود کلسترول در غشاء سلول 12
    1-3-2- مکانیسم عمل سموم وابسته به کلسترول 13
    1-4- همولیزین 14
    1-4-1- نقش همولیزین ایجاد کننده حفره در انتقال ماکرومولکول¬ها در درون سیتوزول با استفاده از لیپوزوم 15
    1-4-1-1- دارو رسانی 15
    1-4-1-2- لیپوزوم 16
    1-4-1-3- انتقال ماکرومولکول¬ها با استفاده از لیپوزوم 17
    1-4-1-4- استفاده از همولیزین در افزایش پایداری لیپوزوم 17
    1-5- داکینگ مولکولی 18
    1-5-1- الگوریتم¬های جستجو 18
    1-5-1-1- روش مونت¬کارلو 18
    1-5-1-2- الگوریتم ژنتیک 19
    1-5-2- تابع رتبه¬بندی 19
    1-5-3- شبیه¬سازی¬های رایانه¬ای 19
    1-5-3-1- شبیه¬سازی مونت¬کارلو 20
    عنوان صفحه
    1-5-3-2- شبیه¬سازی دینامیک مولکولی 20
    1-5-3-2-1- اجرای شبیه¬سازی دینامیک مولکولی 21
    1-5-3-3- انتخاب پیکربندی اولیه 21
    1-5-3-4- به تعادل¬رساندن سیستم 22
    1-5-3-5- دینامیک مولکولی در دما و فشار ثابت 22
    1-5-3-5-1- دمای ثابت 22
    1-5-3-5-2- فشار ثابت 22
    1-6- نرم¬افزار گرومکس 23
    1-7- تاریخچه¬ی مهمترین همولیزین¬های شناخته شده تا به امروز 23
    1-8- اهداف تحقیق 27
    فصل دوم: مواد و روش¬ها 28
    2-1- مواد و وسایل مورد استفاده 28
    2-1-1- دستگاه¬ها و وسایل مورد استفاده 28
    2-1-2- مواد مورد استفاده 29
    2-2-1- محیط کشت نوترینت آگار (NA) 30
    2-2-2- محیط کشت نوترینت براث (NB) 30
    2-2-3- محیط کشت بلادآگار (BAB) 30
    2-2-4- محیط کشت مایع عصاره قلب و مغز (BHIB) 31
    2-3- میکروارگانیسم¬های مورد استفاده 31
    2-4- باکتری¬های مورد مطالعه و شناسایی آنها 31
    2-4-1- بررسی باسیلوس¬های اسپوردار تولیدکننده همولیزین از آب دریا 31
    2-5- روش کشت باکتری¬ها در محیط¬های کشت 32
    2-5-1- روش کشت باکتری¬ها بر روی محیط بلاد آگار 32
    2-5-2- روش کشت باکتری¬ها بر روی محیط مایع عصاره قلب و مغز به همراه 1/0% گلوکز 32
    2-6- محصول تولیدی همولیزین توسط باکتری¬ها و جداسازی بهترین سویه¬ها 32
    2-7- غربالگری انجام تست همولیزین 32
    2-8- استخراج همولیزین 33
    2-8-1- جداسازی پروتئین 33
    2-8-2 الکتروفورز ژل پلیاکریل آمید 33

    عنوان صفحه
    2-8-3- روش کار برای تهیه ژل 36
    2-8-4- سنجش میزان پروتئین محلول 37
    2-8-5- زایموگرافی همولیزین حاصل از سویه M3 38
    2-8-6- استخراج همولیزین از ژلSDS-PAGE 39
    2-8-7- تعیین وزن مولکولی آنزیم تولید شده 39
    2-8-8- رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با کوماسی بلو درخشان R-250 39
    2-9- شناسایی همولیزین سویه¬های مشابه با سویهM3 در NCBI 40
    2-9-1- مدل¬سازی با استفاده از نرم¬افزار MODELLER 40
    2-9-2- ارزیابی مدل ساخته شده با استفاده از نرم-افزار PROCHECK 40
    2-10- شناسایی اسیدهای آمینه درگیر در اتصال همولیزین با گیرنده خود در سطح غشای پلاسمایی با استفاده از نرم¬افزار اتوداک 41
    2-11- شبیه¬سازی همولیزین در غشای لیپوزوم با استفاده از نرم¬افزار گرومکس 43
    2-11-1- مراحل انجام شبیه¬سازی دینامیک مولکولی 43
    فصل سوم: نتایج 47
    3-1- ارزیابی همولیزین تولیدی توسط سویه¬های جداسازی شده 47
    3-2- بررسی همولیز باسیلوس¬های موردمطالعه در محیط بلاد آگار 47
    3-3- جداسازی بهترین سویه با استفاده از Hemolysin Assay 49
    3-4- جداسازی همولیزین با استفاده از نمک آمونیوم سولفات و بررسی حضور آن با استفاده از زایموگرافی آنزیم تولید شده توسط سویه M3 50
    3-5- استخراج همولیزین از ژل زایموگرافی و بررسی فعالیت آن 51
    3-6- تعیین وزن مولکولی همولیزین استخراج شده 52
    3-7- نتایج حاصل از BLAST و Alignment توالی همولیزین سویه M3 52
    3-8- بررسی ویژگی¬های همولیزین باسیلوس پامیلوس SAFR032 با استفاده از وبگاهprot param 54
    3-9- مدل¬سازی با استفاده از نرم¬افزار MODELLER و بررسی کیفیت مدل به دست آمده با استفاده از نرم-افزارهای PROCHECK و Verify3D 54
    3-10- بررسی نتایج حاصل از داکینگ مولکولی 56
    3-11- بررسی شبیه¬سازی دینامیک مولکولی کمپلکس همولیزین و لیپید 58
    3-11-1- آنالیز داده¬های به دست آمده از اجرای نهایی شبیه¬سازی دینامیک مولکولی 58

    عنوان صفحه
    3-11-1-1- فایل¬های تولید شده 58
    3-11-1-2- تحلیل داده¬های خروجی 59
    3-11-1-2-1- محاسبه متوسط انرژی پتانسیل و بررسی سیستم در مجموعه¬های NVTو NPT 59
    3-11-1-2-2- محاسبه همگرایی سیستم یا RMSD 63
    3-11-1-2-3- محاسبه شعاع چرخش پروتئین یا Rg 64
    3-11-1-2-4- بررسی ساختار دوم همولیزین در غشای لیپیدی 65
    3-11-1-2-5- تجزیه و تحلیل داده¬های غشاء 67
    3-11-1-2-5-1- چگالی غشاء 67
    3-11-1-2-4-2- زاویه شیب پروتئین همولیزین در غشاء با گروه لیپیدی غشاء 68
    فصل چهارم: بحث و نتیجه¬گیری 69
    4-1- بررسی تولید همولیزین در باسیلوس¬ها 69
    4-2- شناسایی همولیزین در NCBI و بررسی ویژگی¬های آن 73
    4-3- نتیجه¬گیری کلی 75
    4-4- پیشنهادات 75
    منابع و مآخذ 76



    چکیده :
    چکیده همولیزین یک پروتئین خارج سلولی است که توسط بسیاری از باکتری¬های بیماری¬زا و غیر بیماری¬زا ترشح می¬شود. امروزه قارچ¬های ترشح کننده همولیزین نیز شناسایی شده¬اند. این سم از طریق تجزیه گلبول¬های قرمز خونی در شرایط آزمایشگاه شناخته شده است. سطح فعالیت آنها غشای-پلاسمایی گلبول¬های قرمز خون می¬باشد. بسیاری از همولیزین-ها، جزء سموم ایجاد کننده¬ی حفره درغشاء می¬باشند که به سطح سلول متصل و اولیگومریزه شده و ساختار¬های حفره¬ای شکل را در غشاء پلاسمایی سلول¬های یوکاریوتی ایجاد می-کند. اتصال به غشاء غلظت موضعی سم را افزایش داده و باعث تغییر پیکربندی و در نتیجه تسهیل در اولیگومریزاسیون آن می¬گردد. همولیزین جزء سموم وابسته به کلسترول می¬باشد یعنی کلسترول را به عنوان گیرنده بر روی سطح سلول¬های خونی شناسایی کرده و از طریق آن به سلول هدف متصل می¬شود پس از اتصال مونومر¬های سم به غشاء، اولیگومریزاسیون مونومرها به صورت حفره¬های تراغشایی انجام می¬گیرد که باعث تسهیل نفوذ کنترل نشده¬ی آب، یون¬ها و مولکول¬های آلی کوچک، خروج سریع مولکول¬های حیاتی مانند ATP، از بین رفتن پتانسیل غشاء و شیب یونی، تغییر پتانسیل اسمزی و در نهایت تورم و تجزیه گلبول¬های قرمز خون میزبان می¬گردد. اهدافی که در این تحقیق دنبال می¬شوند عبارتند از: بررسی باسیلوس¬های تولیدکننده¬ی همولیزین و شناسایی آن¬ها به روش¬های بیوشیمیایی و مولکولی، بررسی باسیلوس¬هایی با قویترین همولیزین¬ها و جداسازی بهترین سویه¬ها، زایموگرافی آنزیم استخراج شده، تعیین وزن مولکولی آن، بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی با استفاده از وبگاه¬های بیوانفورماتیکی، تعیین جایگاه اتصال این سم با غشاء و شناسایی اسید¬ های آمینه درگیر در این اتصال با استفاده از نرم¬افزار اتوداک و استفاده از این پروتئین در پایداری لیپوزوم¬های حامل دارو با استفاده از شبیه¬سازی دینامیک مولکولی. در هنگام غربالگری باسیلوس¬ها، سویه M3 بهترین سویه تجزیه کننده¬ی خون در محیط آگار خون¬دار شناخته شد. سپس همولیزین تولیدی توسط این باکتری استخراج گردید و با استفاده از زایموگرافی خصوصیات لیز کنندگی آن در محیط آگار خون¬دار بررسی شد و در نهایت با استفاده از ژل SDS-PAGE وزن مولکولی آن تعیین گردید. از آنجا که توالی کامل سویه¬ی M3 شناسایی نشده است و ژن همولیزین آن مشخص نمی¬باشد، برای انجام کار¬های بیوانفورماتیک سویه¬ای به¬نام باسیلوس پامیلوسSAFR032 با شباهت 99% انتخاب گردید و بر روی همولیزین این سویه در محیط in Silico مراحل بعدی این پژوهش انجام گرفت. اسید¬های آمینه درگیر در اتصال همولیزین و کلسترول، تعداد پیوند هیدروژنی و بهترین شکل فضایی در این اتصال با استفاده از نرم¬افزار اتوداک شناسایی و معرفی گردید و برای شبیه¬سازی این پروتئین در غشا¬های زیستی از نرم¬افزار گرومکس استفاده شد. هدف از این شبیه-سازی بررسی پایداری این پروتئین در غشا¬های زیستی و همچنین مطالعه پایداری غشاء لیپیدی بعد از ورود این پروتئین به داخل غشاء می¬باشد. نتایج شبیه¬سازی مولکولی نشان داد در اثر برهمکنش¬های بین همولیزین و لیپید¬های غشاء این شبیه¬سازی بر روی ساختار همولیزین هیچ تاثیری ندارد و می¬توان از همولیزین به عنوان عاملی در پایداری غشاء لیپیدی استفاده کرد. کلید واژه : همولیزین، باسیلوس M3، باسیلوس پامیلوسSAFR032 ، اتوداک، گرومکس

    چکیده انگلیسی :
    Absteract: Hemolysin is an extracellular protein which is released by many pathogenic and nonpathogenic bacteria. Recent investigations have shown that many clinically relevant fungi also produce hemolysins. Hemolysins can be identified by their ability to lyse red blood cells in vitro. Hemolysin acts on the red blood cell plasma membrane.When the toxin binds to the membranes its local concentration increases, this incrase in concentration facilitate its oligomerisation. Hemolysins which are one of the cholesterol-dependent cytolysins (CDCs) are a large family of pore-forming toxins. It means that the toxin has identified cholesterol on the cell membrane as a receptor and it is connected to cholesterol. Upon binding, the monomers oligomerize to form a water filled transmembrane channel that facilitates uncontrolled permeation of water, ions, and small organic molecules. Rapid discharge of vital molecules such as ATP, dissipation of the membrane potential and ionic gradients, and irreversible osmotic swelling leading to the cell wall rupture (lysis) can cause death of the host cell. The aims of this study are the identification of hemolysin producing by Bacillus spp and their characterization by biochemical and molecular methods, identification of hemolysin with the strongest lyses and isolation of the best one, determinination of binding site the toxin with erytrosit membrane and identification of the amino acids involved in connection with the use of Autodock software, uses of this protein for stabilizing liposomes in drugs delivery by molecular dynamics simulation. When screening for Bacillus spp, the strain was the best parser blood on blood agar media, then the hemolysin produced by this strain was extracted and using zymography the lysis effect of this toxin on blood agar was characterised and the end with the use of SDS-PAGE gel, the molecular weight was determined. Molecular weight of the hemolysin that was produced by strain M3 in the defibrinated sheep blood was obtained. Since the complete genome sequence of strain M3 was not identified, for bioanformatics part B. pumilus SAFR032 with 99 % identity to M3 was used. The amino acids involved in binding of hemolysin and cholesterol, number of hydrogen bonds, and the best conformational in this connection were predicted by Autodock soft ware. The Gromax software simulation of the hemolysin protein in the biological membrane and to examine the stability of the protein in the biological membranes and membrane stability when the hemolysin imported into the lipid membrane. Molecular modeling and simulation results showed that during the interaction between hemolysin and lipids membrane, the structure of hemolysin was remained constant. Keyword: Hemolysin, M3 strain, Zymography, Bacillus pumilus SAFR032, Autodock, Gromax


    کلید واژه ها :
    همولیزین ? باسیلوس M3 ? باسیلوس پامیلوسSAFR032 ? اتوداک ? گرومکس,Hemolysin , M3 strain , Zymography , Bacillus pumilus SAFR032 , Autodock , Gromax

    1392
    0

    صفحه اول : University of Isfahan Faculty of Advanced Sciences and Technologies Department of Biotechnology M.Sc. Thesis Extraction of hemolysin from Bacillus and analysis of its characteristics by Bioinformatics tools. Supervisors: Dr. Hassan Mohabatkar Dr. Giti Emtiazi By: Niloofar Sasani 1392/8/11
    فصل اول : 1-27
    فصل دوم : 28-46
    فصل سوم : 47-68
    فصل چهارم : 69-83
    فصل پنجم :
    فصل ششم :